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柑橘病理项目

使用CRISPR Cas9的无转基因柑橘

orangesGreen

项目总监

彭仲林谅解备忘录

副教授,微生物学与细胞科学
佛罗里达大学
博物馆道981号楼1249室
盖恩斯维尔,FL 32611
电子邮件:zhlmou@ufl.edu
电话:(352)392 - 0285

Co-Project导演

裘德粗俗的

植物细胞遗传学教授
佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
实验站路700号
阿尔弗雷德湖,高度33850
电子邮件:jgrosser@ufl.edu
电话:(863)956 - 8680

首席调查人员

威廉·道森

教授,植物病理学
佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
实验站路700号
阿尔弗雷德湖,高度33850
电子邮件:wodtmv@ufl.edu
电话:(863)956 - 8714

阿米特莱维

植物病理学助理教授
佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
实验站路700号
阿尔弗雷德湖,高度33850
电子邮件:amitlevy@ufl.edu
电话:(863)956 - 4631

迈克Irey

美国糖业公司技术运营部
庞塞德莱昂大道111号
Clewiston, FL 33440

Ozgur Batuman

柑橘病理学助理教授
佛罗里达大学西南佛罗里达研究与教育中心
2685州路29N
Immokalee, FL 34142
电子邮件:obatuman@ufl.edu
电话:(239)658 - 3408

Manjul达特

园艺研究助理科学家
佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
实验站路700号
阿尔弗雷德湖,高度33850
电子邮件:manjul@ufl.edu
电话:(863)956 - 8679

弗拉基米尔•Orbovic

科学实验室经理
佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
实验站路700号
阿尔弗雷德湖,高度33850
电子邮件:orbovic@ufl.edu
电话:(863)956 - 8729

Choaa El Mohtar

植物病理学研究助理科学家
佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
实验站路700号
阿尔弗雷德湖,高度33850
电子邮件:mohtarc@ufl.edu
电话:(863)956 - 8720

合作者

斯坦顿Gelvin

教授,生物科学
普渡大学生物科学系
西州街915号
西拉斐特(47907年
电子邮件:gelvin@purdue.edu
电话:(765)494 - 4939

背景

HLB,或柑橘黄化,于2005年在佛罗里达州首次被发现。亚洲念珠菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)是HLB的致病因子,是一种韧皮部有限的细菌,由亚洲柑橘木虱(ACP)传播。ACP在侵染柑橘植株的韧皮部生长时携带了这种细菌,并在柑橘树丛中移动时将其传播给健康的柑橘树。此时HLB是无法治愈的,会慢慢导致柑橘树的健康下降,最终杀死这棵树。在佛罗里达州,HLB已经蔓延到几乎所有的树木,降低了柑橘产量和果汁质量。自2005年以来,佛罗里达州的柑橘总产量缩水超过50%,导致柑橘包装和加工厂关闭。佛罗里达州果汁市场的生存需要新的种植来增加整体产量。然而,如果没有耐药或耐药的柑橘树,木虱防治措施不足以在大多数新种植中提供生产力。加州正在非常积极地努力防止HLB的建立——尽管他们做出了努力,亚洲柑橘木虱病媒现在已经建立。恢复佛罗里达柑橘产业需要新的树,更好地容忍感染或减少疾病的传播,他们需要立即。

CRISPR / Cas9

CRISPR/Cas9是一种基因编辑技术,已经成功地编辑了细菌、酵母、植物和动物等多种生物的基因。它可以用来删除整个基因,部分基因,或在宿主基因组中产生突变,以提高农业作物的产量。在柑橘方面,这项技术将用于产生短缺失柑橘,这类似于自然突变;因此,通过这种方法生产的柑橘将不会被认为是转基因的,它将更快地提供给种植者,并有更大的变化,有利于佛罗里达州的柑橘行业,以及加州和得克萨斯州的柑橘行业。

我们的项目

在本项目中,我们将在柑橘中建立基于瞬时表达的CRISPR/Cas9基因编辑协议,并利用这些协议生产无转基因的抗hlb或耐hlb的柑橘植株。因为我们预计这在技术上具有挑战性,所以我们试图通过不同的方法和专业知识来提高成功的概率。我们将使用聚乙二醇(PEG)介导的原生质体转化、农杆菌和基因枪轰击等方法瞬时表达作为DNA或RNA引入的Cas9/gRNA,或直接引入预加载gRNA的Cas9蛋白。无转基因CRISPR/Cas9基因编辑方法产生的柑橘会有短缺失,类似于自然突变,因此不被认为是转基因作物。

CRISPR/Cas9技术是基于细菌和古细菌集群规则间隔短回文重复序列(CRISPR)适应性免疫系统清除入侵的病毒和质粒DNA,依赖于Cas9等CRISPR相关蛋白(Cas)的内切酶活性,并由CRISPR rna (crRNAs)定义序列特异性。采用工程的gRNA (single guide RNA)取代crrna,通过gRNA-DNA碱基配对和原间隔邻近基序(PAM,序列:NGG)来确定Cas9与靶DNA的结合特异性。Cas9的核酸酶结构域会切割目标DNA,形成双链断裂。然后,DNA断裂主要通过一种称为非同源末端连接修复的机制进行修复,在这种机制中,DNA碱基随机添加或删除。这个过程很容易通过引入一个过早终止密码子或移码突变来产生突变,导致一个无功能的基因产物。CRISPR/Cas9系统已成功用于在细菌、酵母、植物和动物等多种生物中实现高效的基因编辑。

当CRISPR/Cas9被用来产生突变时,含有Cas9/gRNA基因常被引入宿主基因组,产生转基因产物。对于一年生/二年生作物,转基因作物与非转基因作物杂交后可分离出来。然而,对于多年生植物,如柑橘,这几乎是不可能的。因此,柑橘需要一种无转基因的基因编辑方法。最近,Zhang等人报道了两种简单高效的基因编辑方法,将瞬时表达Cas9/gRNA的愈伤组织细胞作为DNA或RNA引入再生植株。这些方法能够在T0代产生无转基因和纯合子的小麦突变体。

CRISPR - Cas9 -这要归功于Jenna Gallegos博士

贷给UF / IFAS

这要归功于詹娜·加乐高博士

外展

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研究

Mou实验室设计了一系列转基因植物,Orbovic实验室生产了一系列转基因植物,Graham实验室筛选了对口腔溃疡的抗性或耐受性,Dawson实验室筛选了对HLB的抗性或耐受性。哈姆林甜橙的2个品系和邓肯葡萄柚的1个品系对HLB有较高的耐受性。这些植物经PCR检测CLas阳性,但偶尔有轻微的叶片症状,并继续正常生长。因为一种转基因柑橘系的有效性需要它保持耐表型所有通过嫁接产生的子代植株,将原株系4次繁殖到多组子代植株中,每个重复均保持相同的耐受水平。其他的株系,一开始看起来是耐受的,但当繁殖时,有一些不耐受的植物,被丢弃了。

我们正在开发另一种检测方法,以确定耐药树是否会延缓HLB的传播。我们之前证明了clas感染的木虱在健康的野生型柑橘上繁殖时,会感染新的红潮,使若虫获得细菌,导致受感染的后代木虱。我们想知道这种容忍是否源于CLas在新浪潮中增殖和传播的减少。如果是这样,这可能会导致木虱若虫获得cla的能力降低。为验证这种可能性,我们将感染的木虱加入笼内的转基因单株中,通过PCR测定CLas阳性子代木虱的比例。我们惊奇地发现,转基因137-2系的葡萄柚与野生型植物的200-300株相比,后代木虱很少甚至没有。本品系重复10次。到目前为止,我们还没有在任何其他株系(包括表达相同转基因的株系)中看到这种表型,这表明株系137-2携带了柑橘类基因的T-DNA插入突变,这是木虱繁殖所需的。

同时进行的工作是开发减少疾病(抗菌肽)或使用CTV载体控制木虱载体(RNAi)的方法。这些方法的商业化和监管审批申请正在由南方花园柑橘公司完成。CTV矢量暂时保留插入,并将逐渐停止有效。柑橘基因组的改变,以提供抗性,耐受性,或干扰木虱的繁殖和传播,应提供更长的控制。然而,在CRISPR/Cas9修饰的植物可用之前,利用CTV结构在田间找到可以被CTV沉默的基因来提供对HLB或缺乏木虱繁殖的耐受性,可能是一种临时控制措施。

感谢牟仲林博士

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HLB症状,归功于George Ugartemendia

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常见问题和帮助

常见问题

把外来的遗传物质插入细胞中,就可以使一个有机体得到基因改造。CRISPR/CAS9将在这个项目中被用于在基因组中进行小的删除,而不是任何遗传物质的添加。由此产生的植物和水果将是非转基因的,因此不受转基因产品常见的严格监管。

生长在带有小基因缺失的树上的水果可以完全安全的吃新鲜的或喝果汁。这种突变不会影响水果的发育、甜度或果汁的生产。

通过消费者调查和民意调查进行的研究表明,消费者将购买和使用使用CRISPR/Cas9技术制作的柑橘产品,特别是如果它们与转基因食品不同的话。

帮助

新闻和链接

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